人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞HCAEC培養(yǎng)說明書

一、細(xì)胞培養(yǎng)條件

二、細(xì)胞收貨后處理

A、復(fù)蘇細(xì)胞處理方法：培養(yǎng)至良好狀態(tài)后灌滿完全培養(yǎng)液并封好瓶口是運輸細(xì)胞的最好辦法。收到細(xì)胞用75%酒精噴灑整個細(xì)胞瓶，嚴(yán)格無菌后將細(xì)胞瓶放置培養(yǎng)箱中靜置2-4小時以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。靜置后顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照保存（最好40x,100x,200x各一張），前三天照片是重要售后依據(jù)，不提供照片默認(rèn)收到狀態(tài)良好。

B、凍存細(xì)胞處理方法：收到細(xì)胞后，觀察泡沫箱中干冰是否有剩余，凍存管是否完好無損是否有解凍情況，若發(fā)現(xiàn)干冰完全汽化或凍存管有解凍破損現(xiàn)象，請及時拍照并與我們聯(lián)系。如果細(xì)胞簽收三天內(nèi)未與我們聯(lián)系，則默認(rèn)為收貨良好。復(fù)蘇第一管如有活性問題，請及時聯(lián)系我們，技術(shù)人員與您溝通指導(dǎo)后再復(fù)蘇第 二管，未與我方聯(lián)系擅自復(fù)蘇第二管出現(xiàn)問題不予售后。

三、細(xì)胞培養(yǎng)步驟

a、細(xì)胞傳代：如細(xì)胞密度超80%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，步驟如下：

1) 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次；

2) 加1-2mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置培養(yǎng)箱中消化 1-2min ，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后，加6ml含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化；

3) 輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出至離心管中，1000 rpm離心5-8min，棄去上清液，補加1-2mL完全培養(yǎng)基后吹勻；

4) 按5-6mL每瓶補加完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液按1:2的比例分到新的含5-6 mL完全培養(yǎng)基的6cm培養(yǎng)皿中或者T25培養(yǎng)瓶中。

（即1個T25瓶傳代接種至2個T25瓶或者2個6cm的培養(yǎng)皿）

b、細(xì)胞凍存：細(xì)胞收集參照傳代步驟，按凍存數(shù)量（推薦每支凍存管5×10⁶左右細(xì)胞數(shù)量凍存），加入1ml的我司無血清凍存液（貨號：C7001），輕輕混勻后，放-80℃冰箱，24小時后轉(zhuǎn)入液氮罐中。

C、細(xì)胞復(fù)蘇：從液氮灌或-80℃冰箱中找到需要復(fù)蘇的細(xì)胞，水浴鍋提前打開預(yù)熱37℃。

1) 將凍存細(xì)胞在37℃水浴中迅速搖晃解凍；

2) 將凍存管中的細(xì)胞移至含5ml完全培養(yǎng)基的離心管中，1000 rpm離心5min；

3) 棄去上清液，補加5mL完全培養(yǎng)基后吹勻，接種于T25培養(yǎng)瓶中或6cm皿中，培養(yǎng)過夜，第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

四、注意事項：有些細(xì)胞貼壁不牢，在運輸過程中細(xì)胞容易脫落，這是正�，F(xiàn)象。如脫落較多可將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管，1000rpm離心5-8min，收集上清作過渡培養(yǎng)，沉淀加入胰酶1-2ml，輕輕吹打，重懸，消化1-2分鐘后，加5ml完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)。再離心，棄上清，加1-2ml完全培養(yǎng)基重懸。然后按1:2比例進(jìn)行分瓶傳代，補充新的完全培養(yǎng)基至5-6ml/瓶，最后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

五、售后條款：

1）細(xì)胞出現(xiàn)問題，可重發(fā)的情況有哪些？判定標(biāo)準(zhǔn)是什么？

1. 細(xì)胞運輸途中遭遇的各種問題，細(xì)胞丟失、瓶身破損、培養(yǎng)液嚴(yán)重漏液等，重發(fā)；

2. 細(xì)胞污染問題，請在收到產(chǎn)品48小時內(nèi)，給我們提出真實的實驗結(jié)果，核實后重發(fā)；

3. 常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置24小時后，干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后24小時后，絕大多數(shù)細(xì)胞未存活，（需提供真實清晰的細(xì)胞狀態(tài)照片），重發(fā)；

4. 干冰凍存發(fā)貨的細(xì)胞復(fù)蘇后24小時后或常溫發(fā)貨的細(xì)胞靜置4小時候并且未開封，出現(xiàn)污染，重發(fā)；

5. 細(xì)胞活性問題，請在收到產(chǎn)品7天內(nèi)給我們提出真實的實驗結(jié)果，用臺盼藍(lán)染色法鑒定細(xì)胞活力，核實后予重發(fā)；

6. 細(xì)胞收到當(dāng)天以及第2,3天請拍照，3天未告知的，視為產(chǎn)品合格。4-7天內(nèi)出現(xiàn)問題有提供收到細(xì)胞前3天照片和細(xì)胞出現(xiàn)問題時照片以及細(xì)胞相關(guān)操作的詳細(xì)步驟的，并跟技術(shù)人員溝通的，由技術(shù)人員判定為我方責(zé)任的，重發(fā)。技術(shù)人員判定為雙方承擔(dān)責(zé)任的由雙方進(jìn)行協(xié)商處理或者按合同價的50%收費重發(fā)。

2）細(xì)胞出現(xiàn)問題，不予以重發(fā)的情況有哪些？

1. 客戶造成細(xì)胞污染，不重發(fā)；

2. 客戶不正確操作致細(xì)胞狀態(tài)不好，不重發(fā)；

3. 非本庫推薦細(xì)胞培養(yǎng)體系致的細(xì)胞狀態(tài)不好，不重發(fā)；

4. 細(xì)胞狀態(tài)不好，未提供細(xì)胞培養(yǎng)前3天照片的，不重發(fā)；

5. 細(xì)胞培養(yǎng)時經(jīng)其它處理的，不重發(fā)；

6. 細(xì)胞收到2天內(nèi)，未告知，不重發(fā)；

7. 視具體情況而定。 

發(fā)表中文論文標(biāo)注：（細(xì)胞名稱貨號）由上海雅吉生物科技有限公司提供；

發(fā)表英文論文標(biāo)注：（細(xì)胞名稱貨號）Provided by Shanghai Yaji Biotechnology Co., Ltd人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞HCAEC培養(yǎng)說明書